科学与技术
MDCK细胞
流感作为一种季节性流行病，每年在全球造成大量感染和死亡。传统鸡胚基质疫苗存在诸多局限性，而基于MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）细胞的流感疫苗生产技术为解决这些问题提供了创新方案。本文将详细介绍MDCK细胞基质流感疫苗的整体解决方案，并介绍浙江壹生科生物技术有限公司在低成瘤/无致瘤MDCK细胞筛选服务和专用培养基。
01
MDCK细胞基质疫苗的优势
传统鸡胚培养的流感疫苗存在明显的局限性：病毒抗原位点容易发生适应性突变，降低疫苗有效性；生产能力受限于鸡胚供应，在大流行期间难以满足全球需求；还可能引起对鸡蛋蛋白过敏人群的不良反应。相比之下，MDCK细胞基质流感疫苗具有显著优势：
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抗原保真性更高：避免病毒在鸡胚中适应性突变，能更好匹配流行毒株；
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生产效率提升：易于规模化扩增，不受鸡胚供应限制；
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安全性更好：无鸡蛋蛋白残留，减少过敏风险；
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免疫原性增强：细胞基质培养的病毒具有更复杂的糖基化模式，能诱导更强的细胞免疫反应。
02
浙江壹生科可提供低成瘤/无致瘤
MDCK细胞筛选服务
浙江壹生科生物技术有限公司位于浙江省诸暨市，建设有符合GMP规范的培养基生产车间和纯化填料生产车间，致力于为生物制药行业提供高品质的耗材供应及技术支持。无血清悬浮培养的MDCK细胞成瘤性非常强，10个细胞就可引起裸鼠成瘤。中检院细胞鉴定要求中，需要对MCB和EOPC检查成瘤性/致瘤性，如图1所示。壹生科可提供贴壁细胞全悬浮驯化，并筛选获得的低成瘤/无致瘤性的MDCK细胞株等服务。
图1.细胞检定项目要求
part.1
贴壁MDCK细胞的无血清悬浮驯化
快速细胞悬浮驯化策略：快速获得低代次无血清悬浮生长MDCK细胞种群，如图2所示。
图2.快速MDCK细胞悬浮驯化策略
part.2
有限稀释法筛选MDCK单细胞亚克隆株
壹生科通过有限稀释法获得MDCK单细胞亚克隆株，然后对各细胞株进行系统评估。筛选过程评估主要包括：生长能力；极端环境耐受力；直径分布；血凝滴度检测：评估细胞对流感病毒的敏感性；受体丰度检测：确定病毒吸附能力；成瘤/致瘤性检测：通过体内外试验评估安全性等。
成功案例
壹生科的研究团队通过筛选获得了108株单细胞亚克隆株，经过两轮筛选后得到3株候选细胞，最终选定一株名为MDCK-3的亚克隆株作为备选细胞株。该细胞株表现出以下特性：染色体数目众数为78，核型稳定；无细菌、真菌、支原体及外源因子污染；裸鼠致瘤试验阴性，接种部位病理解剖与阴性对照组无显著差异；细胞裂解物和细胞DNA接种裸鼠均未致瘤，表明无致癌性；未见转移瘤，TPD50（半数成瘤剂量） ≤3.98×103活细胞/只裸鼠。
图3.MDCK-3（Type3）细胞与其他克隆细胞的直径分布、生长和病毒滴度的比较
表1.MDCK细胞库检验结果 - 中检院报告
03
壹生科MDCK专用细胞培养基
(以MDCK-3细胞验证培养基性能)
浙江壹生科开发了专门针对MDCK细胞的TS（True Suspension-真悬）系列高端培养基（生长培养基：MDCKS05和病毒扩增培养基：MDCK307V），解决MDCK细胞从贴壁培养升级到全悬浮培养的技术难关。壹生科的TS系列培养基的特点：
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无血清配方：减少外源因子污染风险，提高产品一致性；
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化学组分限定：成分明确，有利于工艺标准化和法规申报；
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支持高密度生长（见图4）：可实现每毫升千万个细胞级别的细胞密度；
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细胞连续传代生长稳定：细胞培养30代能稳定生长，满足生产代次的要求
（见图5）
图4.MDCK-3在生长培养基MDCKS05中的批培养
图5.MDCK-3在生长培养基MDCKS05中的连续传代
按照表2：MDCK细胞流感病毒生产工艺，进行H1N1和BV病毒原液的生产，检测病毒原液的TCID50和HA（结果见图6）。壹生科新技术生产的H1N1和BV病毒原液的TCID50结果相对原工艺有了明显提升，且HA结果基本保持不变，说明壹生科新技术在提升病毒产量的过程中病毒未发生漂移或突变，保持侵染能力。
表2.MDCK悬浮细胞流感接毒工艺表
注释：
[1] MDCK-3细胞培养条件：温度37℃、转速140-160rpm、CO2浓度5%。生长至第三天，细胞密度≥7×106 cells/mL，细胞活率≥95%。
[2] 由于不同的毒株接毒量存在差异，建议接毒量范围在0.01‰-0.1‰，可设计接毒量梯度，确定最优接毒量，工艺稳定性与种毒品质相关，建议选用高品质种毒[HA≥9(log2)、病毒含量≥108.5(EID50/0.1mL)]。
[3] 1:1稀释方式：培养至72h后的细胞悬液：新鲜培养基 = 1:1。
[4] 普通胰酶浓度为100mg/mL，例：按100mg/L添加，30mL接毒体系加入30μL普通胰酶。
[5] 收获时间：由于不同毒株存在差异，需根据实际细胞病变情况确定最优的收获时间，建议收获时间为72-96h。
图6.H1N1和BV病毒原液的TCID50和HA检测结果
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另外壹生科除了提供MDCK高性能专用培养基，还提供全面的MDCK细胞培养工艺优化服务，包括：细胞传代参数优化：确定最佳接种密度；培养条件优化：确定最佳转速，培养温度，二氧化碳浓度；病毒生产参数优化：确定种毒细胞密度，MOI，TPCK-胰酶添加量。同时也能提供MDCK细胞基质疫苗反应器生产工艺的开发，优化及验证工作。
基于MDCK细胞的流感疫苗反应器生产工艺主要包括以下几个环节：反应器悬浮细胞培养阶段：生物反应器中优化培养参数：pH条件：7.0、溶氧：50%、温度：37℃、搅拌速度：70-110 rpm/min（以10Leppdorf反应器为例），深层通气：0.01~0.05VVM；病毒接种与收获优化：优化后的病毒增殖工艺可使流感病毒的血凝滴度显著提升；通过添加TPCK-胰蛋白酶促进病毒复制；采用Triton-X100细胞裂解技术释放细胞相关病毒，使血凝滴度进一步提高。
04
壹生科可提供亚单位疫苗纯化填料
壹生科作为纯化介质供应商可提供用于亚单位流感疫苗纯化的介质，同时技术团队也可以提供高效的纯化策略，协助客户开发或优化纯化工艺，推进产品进度，尽早进入申报或者临床阶段。表3为使用壹生科纯化填料纯化H1N1病毒原液后有效成分HA含量和杂质残留检测结果，均达到药典要求的限度。
表3.H1N1病毒原液纯化杂质残留检测结果
MDCK细胞基质流感疫苗技术代表了流感疫苗生产的未来发展方向。浙江壹生科生物技术有限公司通过提供低成瘤/无致瘤MDCK细胞筛选服务和专用培养基解决方案，为这一技术的推广和应用做出了重要贡献。随着技术的不断成熟和工艺的持续优化，基于MDCK细胞的流感疫苗有望为全球流感防控提供更加有效、安全和可靠的保护。